การแยกจีนออกจากโครโมโซมของเซลล์

เนื่องจากจีนเดี่ยวหนึ่งจีนเป็นส่วนเล็กๆ บนโครโมโซมเท่านั้น เพราะฉะนั้นการแยกชิ้นส่วน DNA ที่มีจีนที่ ี่ต้องการจึงมักใช้วิธี 2 วิธี ดังนี้คือ
1. การทำ DNA library ที่ประกอบด้วยชิ้นส่วน DNA หลายๆ พันจาก โครโมโซม ของเซลล์
2. การตรวจชิ้นส่วนของ DNA ที่มีจีนที่ต้องการ โดยใช้ลำดับของเบส


DNA Library เป็นการรวบรวมชิ้นส่วน DNA จากจีนของสิ่งที่มีชีวิตที่สนใจ และแต่ละชิ้นส่วนจะจับอยู่กับ cloning vector นั่นคือ genomic DNA จะถูกตัดเป็นชิ้นส่วน DNA หลายๆพันชิ้นส่วน และทุกชิ้นส่วนจะถูกใช้ ในการทำ cloning DNA การเตรียม vector สำหรับ cloning ทำได้โดยใช้เอนไซม์เรสตริกชันเอนโดนิวคลีเอส ตัด vector DNA ที่ทำให้บริสุทธิ์แล้วตรงบริเวณที่เหมาะสม genomic DNA ที่จะใช้ทำ cloning จะถูกลด ขนาดชิ้นส่วนให้เหมาะสม

โดยการย่อยบางส่วนที่ใช้เอนไซม์เรสตริกชันเอนโดนิวคลีเอสชนิดเดียวกันกับที่ใช้สำหรับย่อย vector เสร็จแล้ว นำมา centrifuged โดยใช้ sucrose density gradient (isopycnic) centrifugation เพื่อกำจัดชิ้นส่วน DNA ที่ใหญ่เกินหรือเล็กเกินกว่าที่จะถูก cloned ใน vector ที่คัดเลือกแล้ว นำชิ้นส่วน DNA ที่เหมาะสมมา ผสมกับ vector DNA เพื่อให้เชื่อม ต่อกัน แล้วจึง transform เข้าไปในเซลล์แบคทีเรีย หรือบรรจุใน bacteriophage particle ผลสุดท้ายได้แบคทีเรีย หรือ bacteriophage จำนวนมากที่มีโมเลกุล recombinant DNA แตกต่างกัน ถ้าการทำ DNA library ได้ DNA ในจีโนมเกือบทั้งหมด เรียกว่า genomic library แต่ละ transformed bacteria จะเจริญเติบโตเป็น colony หรือ clone ของเซลล์จำนวนมากซึ่งทุกเซลล์ จะมี recombinant plasmid เหมือนกัน

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


การทำ DNA library สามารถเลือกเฉพาะจีนที่มีการแสดงออกเท่านั้นได้ จีนที่มีการแสดงออกต่างจากจีนที่เป็น noncoding DNA ตรงที่มันสามารถจะถูกถอดรหัสเป็น RNA mRNA จากสิ่งที่มีชีวิตเฉพาะหรือเซลล์เฉพาะถูก สกัดออกมาเพื่อสร้าง complementary DNA หรือ cDNA โดยเอนไซม์ รีเวอสทรานส์คริพเทส (reverse transcriptase) เราจะได้ชิ้นส่วน DNA สายคู่ที่จะเข้าไปแทรกอยู่กับvectorที่เหมาะสม เพื่อทำ cloning clone ของเซลล์ลักษณะเช่นนี้เรียกว่า cDNA library


การวิเคราะห์ clone ด้วยชิ้นส่วน DNA ที่ต้องการด้วยวิธีไฮบริไดเซชัน
หลังจากทำ DNA library แล้วต้องแยกจีนที่สนใจออกจากชิ้นส่วน DNA จำนวนมากใน DNA library เนื่องจาก จีนแต่ละจีนมีลำดับของนิวคลีโอไทด์ที่จำเพาะ เพราะฉะนั้นจึงตรวจวิเคราะห์ได้โดยใช้การติดฉลากด้วยสารกัมมันตรังสีช่วยชิ้นส่วน DNA ที่มีลำดับของเบส complement กับชิ้นส่วน DNA ที่สนใจ เรียกว่า "probe" การตรวจวิเคราะห์ทำได้โดยนำแผ่นไนโตรเซลลูโลส (nitrocellulose) มากดบน agar plate ที่มี colony ของแบคทีเรียจำนวนมากแต่ละ colony ประกอบด้วย recombinant DNA ที่แตกต่างกัน บางเซลล์จาก colony จะติดบนแผ่นไน-โตรเซลลูโลส นำแผ่นกระดาษนี้มาแช่ในด่างเพื่อทำลายเซลล์ และทำให้ DNA เสียสภาพรรมชาติ (denatured) เมื่อเติม DNA probe ที่ติดฉลากด้วยสารกัมมันตรังสี จะเกิดกระบวนการแอนนีลิง(annealing) ระหว่าง DNA probe กับ DNA ที่มีลำดับของเบส complement กันสารกัมมันตรังสีจะทำให้เกิดแถบมืดบนแผ่นฟิลม์ X-ray ทำให้เราสามารถมองเห็นได้ เป็นวิธีที่เรียกว่าทำ autoradiography การตรวจวิเคราะห์ในลักษณะเช่นนี้ เรียกว่า การทำไฮบริไดเซชัน


การเตรียม probe อาจเตรียมจากโปรตีนซึ่งเป็นผลผลิตของจีน เมื่อทราบการเรียงลำดับของกรดอะมิโน รหัสทางพันธุกรรมทำให้เราออกแบบและสังเคราะห์ probe ในลักษณะเช่นนี้ได้ การออกแบบ probe เพื่อตรวจ วิเคราะห์จีนสำหรับโปรตีนที่ทราบลำดับของกรดอะมิโน เนื่องจากรหัสทางพันธุกรรมมีคุณสมบัติ degenerate จึงทำให้มีลำดับของเบสมากกว่า 1 ที่จำเพาะต่อลำดับของกรดอะมิโน การออกแบบ probe ควรจะเลือกลำดับ ของเบสในช่วงที่มี degeneracy น้อยที่สุด probe เป็นโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ (synthetic oligonucleotide) ที่มีลำดับของเบสได้ 8 แบบ แต่ probe 1 แบบเท่านั้นที่สามารถมีลำดับของเบส complement กับจีนได้อย่างสมบูรณ์


เทคนิค Fingerprinting
เทคนิค fingerprinting หรือ DNA typing หรือ DNA profiling ขึ้นอยู่กับ sequence polymorphism ซึ่งเกิด ขึ้นในจีโนมของคนและสิ่งที่มีชีวิตอื่นๆ sequence polymorphism เป็นลำดับของเบสที่มีความแตกต่างกัน เล็กน้อย โดยทั่วไปมีคู่เบสเปลี่ยนแปลงไป 1 คู่เบส ซึ่งเกิดขึ้นทุกๆ 200-300 bp

การเปลี่ยนแปลงลำดับของเบสเช่นนี้จะเกิดขึ้นแตกต่างกันไปในคนแต่ละคน และมีผลต่อบริเวณที่จำเพาะต่อการ ทำงานของเอนไซม์เรสตริกชัน เอนโดนิวคลีเอส ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงขนาดของชิ้นส่วน DNA ที่เกิดขึ้น จากการย่อยด้วยเอนไซม์ที่เฉพาะ ขนาดของชิ้นส่วน DNA ที่แตกต่างนี้เรียกว่า restriction fragment length polymorphisms หรือ RFLPs การตรวจวิเคาะห์ RFLPs ใช้วิธีไฮบริไดเซชันพิเศษที่เรียกว่า "Southern blotting" ชิ้นส่วน DNA ที่ได้จากการย่อย genomic DNA โดยเอนไซม์เรสตริกชันเอนโดนิวคลีเอส ถูกแยกออก จากกันโดยใช้เทคนิคอิเล็กโทรโฟรีซิสแบบอะกาโรสเจล ทำให้ชิ้นส่วน DNA เสียสภาพธรรมชาติโดยแช่เจลใน ด่างแล้วจึงย้ายมาอยู่บนแผ่นกระดาษไนโตรเซลลูโลส แช่แผ่นกระดาษในสารละลายที่ประกอบด้วย DNA probe ที่ติดฉลากด้วยสารกัมมันตรังสี ชิ้นส่วนDNAที่จับคู่เบสกับprobe เมื่อทำ autoradiography จะเกิดแถบมืดบน แผ่นฟิล์ม X-ray ลำดับเบสของ genomic DNA ที่ใช้ในการตรวจวิเคราะห์นี้ โดยทั่วไปประกอบด้วย repetitive DNA (ลำดับของเบสสั้นๆ ที่ซ้ำกันเป็นหลายพันครั้งติดต่อกัน) ซึ่งพบบ่อยในจีโนมของ ยูคาริโอตชั้นสูง จำนวน ของหน่วยซ้ำนี้จะเปลี่ยนแปลงจากคนหนึ่งไปสู่อีกคนหนึ่ง (ยกเว้นในกรณีของ identical twins) ถ้าเลือก probe ที่เหมาะสมได้ แบบของแถบ (pattern of bands) ที่ได้จากการทำ Southern blotting สามารถบอกถึงความ แตกต่างของชิ้นส่วน DNA ที่ได้มาจากแต่ละคน อย่างไรก็ตามเทคนิค Southern blotting ต้องใช้ DNA ค่อนข้างใหม่และปริมาณ DNA ต้องมาก การเพิ่มความไวในการวิเคราะห์ RFLP นี้ทำได้โดยใช้เทคนิค PCR (polymerase chain reaction) เพิ่มขยาย DNA ปริมาณน้อยให้ได้ปริมาณมากๆ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


HOME
ที่มา:http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/ spring2003/Williford/DNA%20fingerprint.gif
ที่มา: http://fig.cox.miami.edu/Faculty/Dana/genomiclibrary.gif