DNA sequencing

DNA Sequencing เป็นเทคนิคที่สำคัญที่สุดสำหรับ molecular biologist ทำให้ทราบถึงลำดับของ นิวคลีโอไทด์ ของ DNA DNA sequencing มี 2 วิธีคือ
1. the chain termination method โดย Frederick Sanger และ Andrew Coulson
2. the chemical degradation method โดย Walter Gilbert

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


The Sanger-Coulson Method
วิธี chain termination ต้องการ DNA สายเดี่ยวและโมเลกุลที่จะหาลำดับของนิวคลีโอไทด์ มักจะถูก cloned ลงใน M13 vector ที่เป็นเช่นนี้เพราะวิธีนี้ต้องการ การสังเคราะห์ DNA สายที่ 2 โดยการใช้เอนไซม์ ซึ่ง
DNA สายที่ 2 นี้จะมีลำดับของเบส complement กับลำดับของเบสบน DNA แม่พิมพ์


ขั้นแรก ต้องให้สายโอลิโกนิวคลีโอไทด์สั้นๆ จับคู่กับ recombinant M13 molecule โอลิโกนิวคลีโอไทด์นี้จะ ทำหน้าที่เป็นไพรเมอร์ สำหรับการสร้างสายใหม่ที่ complement กับชิ้นส่วน DNA ที่เติมเข้าไปในจีน M13 เอนไซม์ที่ใช้ในการสร้างคือ รูปดัดแปรของ DNA พอลิเมอเรส I (modified form of DNA polymeraseI)

นอกจากนี้ยังต้องมีดีออกซีนิวคลีโอไทด์ 4 ชนิดคือ dATP,dTTP, dGTP และ dCTP รวมทั้งนิวคลีโอไทด์ที่ถูก ดัดแปลงชนิดหนึ่งคือ ไดดีออกซีนิวคลี-โอไทด์ (dideoxynucleotide,dideoxy ATP) ซึ่งสามารถเข้าไปอยู่ใน สายพอลินิวคลีโอไทด์ สายใหม่เช่นเดียวกับดีออกซีนิวคลีโอไทด์ 4 ชนิดดังกล่าว เมื่อ dideoxy ATP เข้าไปอยู่ในสายจะทำให้หยุดการสร้างสายต่อไป ทั้งนี้เพราะ dideoxy ATP ขาดหมู่ OH ที่ตำแหน่ง 3'ของน้ำตาล ซึ่งหมู่นี้จำเป็นสำหรับ การจับของนิวคลีโอไทด์หน่วยใหม่


ถ้าเติม dideoxy ATP ในปฏิกิริยาจะทำให้หยุดการเพิ่มความยาวที่ตำแหน่งตรงข้ามกับ ไธมิดีน (thymidine) ในสายแม่พิมพ์ แต่การหยุดการเพิ่มความยาวจะไม่เกิดขึ้นที่ T ตัวแรก เนื่องจากมี dATP อยู่ในสารละลาย dATP จะเข้าไปแทนที่ dideoxy ATP ผลของปฏิกิริยาจะได้สายใหม่ทุกสายมีความยาวแตกต่างกัน และแต่ละสายมีปลายเป็น dideoxy ATP เมื่อใช้ไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด คือ dideoxy ATP,dideoxy TTP,dideoxy GTP และ dideoxy CTP สำหรับปฏิกิริยาการสร้างสายใหม่

ผลของปฏิกิริยาจะได้พอลินิวคลีโอไทด์ที่ต่างกัน 4 ชนิด แต่ละชนิดมีปลายเป็น dideoxy ATP, dideoxy TTP,dideoxy GTP และ dideoxy CTP


ขั้นตอนต่อไปคือ การแยกพอลินิวคลีโอไทด์ที่มีความยาวต่างกันของแต่ละชนิด โดยใช้เทคนิคอิเล็กโทรโฟรีซิส แบบพอลิอะคริลาไมด์เจล (polyacrylamide gel electrophoresis) ผลที่ปรากฎให้เห็นเป็นแถบ (band) จำนวนมาก แต่ละแถบเป็นโมเลกุล DNA ที่มีความยาวแตกต่างกัน

โดยทั่วไปโมเลกุลDNAถูกติดฉลากด้วยสารกัมมันตรังสีจึงสามารถเห็นแถบได้โดยการทำ autoradiography
M13 vector เป็น M13 phage particle ซึ่งจะถูกปล่อยออกจากเซลล์แบคทีเรียเจ้าบ้านอย่างต่อเนื่อง phage particle นี้มี M13 จีโนมเป็นสายเดี่ยว เพราะฉะนั้นจีนที่เข้าไปต่ออยู่ใน M13 vector จึงเป็น DNA สายเดี่ยว DNA สายเดี่ยวนี้ถูกใช้ในเทคนิคหลายเทคนิคเช่น DNA sequencing

HOME
ที่มา: http://genetics.nbii.gov/images/sequence6.gif