Gel Filtration Chromatography

Gel Filtration Chromatography เป็นเทคนิคที่ใช้แยกสาร macromolecule เช่น โปรตีน โดยอาศัยความแตกต่างของขนาดโมเลกุล นอกจากนี้ยังเป็นเทคนิคที่ใช้ในการกำจัดสารปนเปื้อนที่มีน้ำหนักโมเลกุลน้อยๆ และยังใช้ประโยชน์ในการหาน้ำหนัก โมเลกุลของสารได้อีกด้วย
- Supporting medium: ตัวกลางเจลที่มีส่วนประกอบเป็น polymer ของสาร เช่น carbohydrate มาเชื่อมโยงเป็น ตาข่ายร่างแห เกิดลักษณะเป็นรูพรุนที่ยอมให้สารโมเลกุลเล็กผ่านเข้าออกได้ แต่สารโมเลกุลใหญ่กว่าขนาดของรูพรุน จะไม่สามารถผ่านเข้าออกได้
- Stationary phase: สารละลายที่กระจายอยู่ในรูพรุนของตัวกลางเจล
- Mobile phase: สารละลายที่กระจายอยู่ในช่องว่างระหว่างเม็ดเจลหรือสารละลายที่ล้อมรอบเม็ดเจล


Kd (Distribution coefficient) คือ ค่าสัมประสิทธิ์ของการกระจาย เป็นความสามารถในการแพร่กระจายของ สารใน รูพรุนของเจล

Kd
=
ปริมาตรสารละลายที่ใช้ชะสารออกจากคอลัมน์ (Ve) – ปริมาตรสารละลายที่ล้อมรอบเม็ดเจล (Vo)
   
ปริมาตรทั้งหมด (Vt) – ปริมาตรสารละลายที่ล้อมรอบเม็ดเจล (Vo)

การหาน้ำหนักโมเลกุลโดย เทคนิค Gel Filtration Chromatography หาค่าน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน (unknown) โดยการเขียนกราฟระหว่างค่า Kd และ log ของน้ำหนักโมเลกุล (kD) ของโปรตีนมาตรฐาน กราฟที่ได้เป็นกราฟเส้นตรง นำค่า Kd unknown ที่คำนวณได้มาใช้หาค่าน้ำหนักโมเลกุลของ unknown จากกราฟนี้
ตัวกลางเจล มีหลายชนิดคือ
1. Dextran: มีชื่อการค้าว่า sephadex เป็น polymer ของ glucose ซึ่งมีหน่วย glyceryl ether เชื่อมโยงระหว่าง หมู่ไฮดรอกซิลของ glucose polymer chain เป็นตาข่ายร่างแห ใช้แยกสารที่มีน้ำหนักโมเลกุลตั้งแต่ 0.7-800 kD
2. Polyacrylamide: มีชื่อการค้าว่า bio-gel ใช้แยกสารที่มีน้ำหนักโมเลกุล 0.2-400 kD
3. Agarose: มีชื่อการค้าว่า sepharose เป็น polymer ของ D-galactose และ 3, 6 anhydro L-galactose ที่ใช้ ้แยกสารที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงมากถึง 40,000 kD


ประโยชน์ของ Gel Filtration Chromatography
1. Desalting: ในระหว่าง protein purification จะมี inorganic salts หรือ low molecular weight reagents ปะปนอยู่ในสารละลาย ซึ่งต้องถูกกำจัดออก นิยมใช้ sephadex G-10 หรือ sephadex G-25 column และได้ผลดีกว่า dialysis
2. ทำให้สารละลายที่เจือจางมีความเข้มข้นขึ้น: ใช้ dry sephadex G-25 coarse ใส่ลงในสารละลายที่เจือจางของสารที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง sephadex จะดูดน้ำระหว่าง swelling สุดท้ายกำจัด sephadex ออกโดยใช้วิธี centrifugation
3. การหาน้ำหนักโมเลกุลของสาร เช่น โปรตีน: โดยหาค่า Kd ของ standard protein แล้วนำมาเขียนกราฟมาตรฐาน ระหว่างค่า Kd และ log molecular weight จะได้กราฟเส้นตรง
4. Fractionation หรือ Purification: ใช้ใน separation เช่นเดียวกับ purification ของ biological materials


HOME
ที่มา: http://www.erin.utoronto.ca/~w3bio/JBC372/lecture02_2004/img014.gif